Gen-Manipulations-Set (Part I)


'Alexander Popper Alexander Popper / 'Katrin Stockhammer Katrin Stockhammer

GENTRANSFER IN PFLANZEN

LIGATION VON GEN X IN DAS PLASMID

TRANSFORMATION

• 100 ml kompetente Bakterien (Escherichia coli) auf Eis auftauen und mit der Plasmid DNA versetzen


• Nach 20 min. die Bakterien 90 sec. bei 42°C (Wärmeschock) belassen und erneut 2––3 min. auf Eis transferieren


• Dem Ansatz 900 ml SOB–Medium zugeben und 1 h bei 37°C schütteln • 100–250 ml davon auf LBamp–Agar ausplattieren

AMPLIFIKATION DER PLASMID DNA

• 2–3 ml Selektivmedium mit transgenen Bakterien inokulieren und über Nacht bei 37°C schütteln


• Abzentrifugieren bei 4000 rpm


• Den Überstand entfernen und das Pellet in 300 ml STETL (Saccharose–Tris EDTA TritonX–100® Lysozym) resuspendieren


• Nach 3 min. auf Eis wird 3 min, auf 95°C transferieren und anschließend 15 min. bei 14000 rpm abzentrifugieren


• Mit einem sterilen Zahnstocher das Pellet vorsichtig entfernen und den verbleibenden Überstand, der die Plasmid–DNA enthält, mit 1mg RNase A 15 min. bei Raumtemperatur inkubieren


• Die DNA mit Isopropanol präzipitieren und 15 min. abzentrifugieren


• Das gewaschene und getrocknete Pellet in 20 ml 1xTE (Tris EDTA) lösen

CHARAKTERISIERUNG DER PLASMID–DNA

• Agarose in 0.5x TPE (Tris Phosphat EDTA) aufkochen und nach dem Abkühlen mit 5 ml Ethidiumbromid / 100 ml versetzen

• Das noch flüssige Gel in einen tray gießen und nach dem Erhärten in eine mit 0.5 x TPE gefüllte Pufferkammer transferieren


• Die zu analysierenden DNA–Proben mit Auftragspuffer versetzen und in die slots pipettieren

TRANSFORMATION VON UNDIFFERENZIERTEN PFLANZENZELLEN MIT DER FREMD–DANN

• Zellkern treffen

REGENERATION VON VOLLSTÄNDIGEN TRANSGENEN PFLANZEN AUS DER TRANSFORMIERTEN GEWEBEKULTUR

• Kalli auf SIM (shoot inducing medium) transferieren


• SIM:
  IPA (Isopentenyladenosine) – 4.0 mg/l
  NAA (Naphtol acetic acid) –0.2 mg/l
  MS (Murashige & Skoog) salts – 4.4g/l
  Saccharose – 30g/l
  Vitamix – 2 ml/l
  Agar –– 9g/l
  pH – 5.8 (KOH)